單細胞測序( Single-Cell Sequencing) 無疑是2019生物領(lǐng)域最火的熱點之一，應(yīng)用這一技術(shù)發(fā)表的文章越來越多，截止目前，國內(nèi)科學(xué)家已經(jīng)發(fā)表了107篇高分文章，涉及到的物種有人類，小鼠，果蠅，斑馬魚，鹿，扇貝，擬南芥，擬蘭，棉花，罌粟等等；關(guān)于單細胞研究的組織類型有胚胎，腦，視網(wǎng)膜，心臟，胰腺，前列腺，胃，脂肪，骨髓等等......在這百余篇高分文章中，有90篇是在2019年發(fā)表的，期待2020年的單細胞文章大爆發(fā)！

今天我們就詳細的講解一下單細胞測序神器。

研究背景

隨著生物學(xué)的不斷發(fā)展，細胞群體的研究已不再能滿足科研需求；單細胞測序解決了用組織樣本測序或樣本少時無法解決的異質(zhì)性難題，為科學(xué)家解析單個細胞的行為、機制、與機體的關(guān)系提供了新方向，單細胞測序已逐漸成為科研熱點。

單細胞測序即從單個細胞水平上對基因組或轉(zhuǎn)錄組進行高通量測序分析的一項新技術(shù)。與傳統(tǒng)高通量測序相比，單細胞測序不僅能夠分析相同表型細胞的異質(zhì)性，還能獲取難以培養(yǎng)微生物的遺傳信息以及珍貴的臨床樣本的信息，具有廣闊的應(yīng)用前景。

把基因測序應(yīng)用到單個細胞層面，對于識別細胞的類型、功能，特定細胞健康或狀態(tài)的變化、變異至關(guān)重要，已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)，種系傳播，器官生長，癌癥生物學(xué)等多個領(lǐng)域。 

10x Chromium Controller

單細胞水平的高通量基因表達譜分析，對復(fù)雜細胞群體深入分析，表征單個細胞的表達譜。可同時檢測CRISPR干擾、細胞表面蛋白，避免單個細胞的異質(zhì)性生物學(xué)信息被大量細胞的均質(zhì)化掩蓋。

10x Genomics 3'單細胞表達譜分析，通過微流體芯片將單個細胞分配到單個油包水液滴中，進行反應(yīng)。同時可以獲得 100-10000個細胞的表達信息，從而實現(xiàn)對細胞群體的劃分與細胞群體間基因表達差異的檢測，是腫瘤細胞異質(zhì)性、免疫細胞群體檢測以及胚胎發(fā)育研究的黃金方法。

基于Feature Barcoding技術(shù)，可檢測細胞表面蛋白，能同時評估mRNA和蛋白表達譜的差異，獲得更詳細的細胞表型特征。

技術(shù)原理

10x Genomics儀器小巧，但功能強大，具有通量高、靈活性強、流程簡單、技術(shù)性能高、單個細胞制備成本低等優(yōu)勢，其技術(shù)核心是油滴包裹的凝膠珠（GEM），該系統(tǒng)有數(shù)百萬種barcoded bead。

技術(shù)優(yōu)勢

通量高，一次可以同時測8個樣本；

每個樣本可測10000個細胞；周期短，

18分鐘內(nèi)完成上萬個細胞封裝；

一天之內(nèi)完成細胞懸液制備、單細胞捕獲、cDNA擴增以及建庫；

捕獲效率高，單細胞捕獲效率高達65%；

應(yīng)用范圍廣，動物細胞、植物細胞均可以進行單細胞測序。

技術(shù)流程    

GEM形成后，細胞裂解，凝膠珠自動溶解釋放大量barcode序列，隨后mRN逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶有Barcode和UMI標記的cDNA。 

油滴破碎，cDNA為模板進行PCR擴增，然后進行酶切、末端修復(fù)、加測序接頭P5及測序引物R2等傳統(tǒng)二代測序的建庫過程。 

測序后，得到每個細胞的轉(zhuǎn)錄組表達譜。

數(shù)據(jù)分析

10x提供免費的專業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件：    

Cell Ranger分析流程，是10x Genomics針對單細胞轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)的完整分析流程，結(jié)合轉(zhuǎn)錄比對數(shù)據(jù)和標示細胞的barcode信息，該流程能進行細胞聚類、差異基因篩選、差異基因功能分析。

Loupe Cell Browser 可視化分析

樣本準備 

細胞類型：生殖細胞、胚胎細胞、神經(jīng)細胞、免疫細胞、腫瘤細胞、干細胞、其他原代細胞等動物細胞；植物細胞（提取原生質(zhì)體)。 

細胞狀態(tài)：細胞直徑<40μm（≥40μm時，需抽取細胞核）；細胞活性>90%；細胞濃度5×10⁵~1.2×10⁶/ml；雙細胞率低于5%；在制備細胞懸液時，緩沖液不含Ca²⁺和Mg²⁺。 

應(yīng)用領(lǐng)域

腫瘤（微環(huán)境、耐藥、免疫等）；細胞異質(zhì)性研究；新型細胞發(fā)現(xiàn)；發(fā)育及分化；免疫反應(yīng)；構(gòu)建細胞圖譜；定點編輯基因的細胞水平研究……

應(yīng)用方向

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